Cultivo de Embriones In Vitro
El proceso de fertilización in vitro consiste en facilitar la unión de los gametos masculinos y femeninos para la formación del cigoto. Hay tres factores que impactan directamente en el resultado de este proceso. La calidad y maduración de ovocitos, la calidad y capacitación de los espermatozoides, y las condiciones de incubación durante la fertilización que incluye temperatura, atmósfera, composición del medio de fertilización y el tiempo de incubación.
Durante la fertilización in vitro, se toman óvulos maduros de los ovarios y se fertilizan con esperma en un laboratorio. Luego se realiza un procedimiento para colocar uno o varios de los óvulos fecundados o embriones en el útero, que es el lugar donde se desarrollan los bebés. Un ciclo completo de fertilización in vitro dura entre 2 y 3 semanas. A veces estos pasos se dividen en diferentes partes y el proceso puede tardar más tiempo.
Figura 2. Ovocitos no fertilizados
La concentración de semen que se desea en la gota de fertilización es generalmente de 1 millón de células/ml cuando se usa semen convencional, o el doble de concentración cuando se trata de semen sexado. En un estudio realizado se encontró que las concentraciones de 0.25 x 106 y 0.5 x 106 espermatozoides/ml generó mayor cantidad de blastocistos. La cantidad de espermatozoides en pajuelas de semen convencional es muy variable, por lo que se recomienda cuantificar la concentración de semen. Para ello se puede utilizar el sistema computarizado para análisis de semen, o se puede hacer conteo en un hematocitómetro.
SELECCIÓN Y PREPARACIÓN DE SEMEN
La selección de toros en programas de cruzamiento se hace con base en las características genéticas deseadas, sin embargo, es necesario verificar la habilidad del semen para fertilizar in vitro. Actualmente no existen parámetros en el semen como motilidad, concentración, o incluso fertilidad a campo de los toros que permitan predecir la fertilidad in vitro. Por lo tanto, el semen de toros elegidos para producción de embriones mediante esta técnica debe ser probado previamente.
Figura 2. Cultivo embrionario
PROCEDIMIENTO
El número deseado de espermatozoides, diluído en el medio de fertilización se deposita en micro gotas cubiertas con aceite mineral. El volumen de la microgota varía según el medio y condiciones a utilizar. En todos los casos, las microgotas para fertilización deben ser preparadas con dos horas de anticipación (mínimo) para permitir que el medio de fertilización, en la atmósfera de incubación, alcance el ph de 7.4. Simultáneamente, se agregan ovocitos maduros y lavados a las microgotas para co-incubar los gametos a 38.5 °C y 5% CO2. Algunos estudios sugieren que el tiempo de co-incubación de los gametos no afecta los resultados de PIV, incluyendo periodos de 4, 8, 12, 16, 20, 24 y 28 horas. Asimismo, el proceso de fertilización implica secreción de proteasas por parte de los espermatozoides para digerir la zona pelúcida. Todos estos cambios bioquímicos en los gametos, se traducen en cambios en el microambiente que eventualmente puede tener efectos negativos sobre los cigotos
CULTIVO DE EMBRIONES IN VITRO
- Una vez que los ovocitos han sido expuestos a espermatozoides y el periodo de fertilización in vitro se cumplió, los cigotos presuntivos deben ser incubados en condiciones optimizadas para el desarrollo embrionario. Generalmente la incubación es de 7 días, esperando el desarrollo de los embriones hasta el estadio de blastocisto.
- La complejidad y susceptibilidad del cultivo de embriones in vitro se refleja en la larga lista de factores dentro del proceso que afectan directamente los resultados obtenidos. Entre ellos están el tipo de medio de cultivo utilizado, así como si el medio contiene o no suero fetal, las condiciones atmosféricas, entre otros.
EVALUACIÓN DEL DESARROLLO Y CLASIFICACIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
La evaluación morfológica de los embriones durante el cultivo es importante para identificar ovocitos infertilizados (figura 2), determinar si el desarrollo ocurre acorde a la edad del embrión, detectar anormalidades y calificar a los embriones según las características morfológicas.